地高辛 DIG 應用小帖士

DNA 的標記和檢測（Southern Blotting）
     如果用以探針合成的DNA 的模板的數量比較少或是質量不夠高的時候，建議您使用PCR DIG Probe Synthe
sis Kit。該試劑盒是于制備高靈敏度的雜交探針，例如單拷貝的基因。其另一個特點就是無需定量斑點檢測
過程，通過定量凝膠電泳就可以快速確定PCR 標記探針的效率。
     如果您手上有足夠量的高純度模板，建議您選用隨機引物標記方法的DIG High Prime DNA Labeling and D
etection Starter Kits I 和II。這兩個試劑盒包含了標記，封閉，雜交和檢測所需要的所有試劑，是真正意義上的
一站式服務的試劑盒，提供您DIG 標記和檢測實驗需要的所有產品。它們之間的差別在于檢測方法的不同：Sta
rter Kits I 采用了顯色法，使用LE NBT/BCIP；而Starter Kits II 選用化學發光法底物CSPD。
RNA 的標記和檢測（Northern Blotting）
     在Northern blotting 中即可以使用DNA 探針，也可以使用RNA 探針。通常，RNA 探針的特異性和靈敏度度
都會更高一些；當然如果對靈敏度和特異性沒有特別嚴格的要求的話，DNA 探針會更方便操作。
     如果您需要制備RNA 探針的話，推薦您使用Northern Starter Kit。該試劑盒以線性的DNA 為模板，通過SP
6, T7 或是T3 RNA 聚合酶的作用將DIG-11-UTP 摻入到轉錄的RNA 中，借助化學發光底物CDP-Star 檢測。另
一個產品DIG RNA Labeling Kit 也可用于RNA 探針的標記。
標記探針的定量
      盡管DIG 系統的靈敏度很高，為了獲得理想的實驗結果，標記探針和模板的用量是很重要的。同樣在每次標
記實驗后，通過spot test 檢測探針的標記效率也是非常重要的，可用以準確計算雜交實驗中的探針用量。雜交實
驗中探針用量的不準帶來的影響是顯而易見的：探針的用量太多會帶來太多的背景問題，而探針的用量過少，則
又會導致雜交信號太弱。DIG 系統的優勢就在于：DIG PCR 探針的產量可以通過凝膠電泳的方式來定量。RNA
探針則可以檢測到探針的完整性。
雜交溫度
      雜交條件的優化取決于雜交片段的類型以及GC 含量。RNA-RNA 和RNA-DNA 間的雜交溫度就要比DNADNA
間的高?？傮w來說，不同片段間的雜交作用力RNA-RNA>RNA-DNA>DNA-DNA。因此做為一個通常的規
律，以40％GC 含量的哺乳動物目的片段為例，在DIG Easy Hyb (DIG 系統，無毒，不含DNase、RN
ase 和任何的污染物) 或是50％甲酰胺存在環境下的雜交溫度分別是：

DNA-DNA: 37-42℃
DNA-RNA: 50℃
RNA-RNA: 68℃

靶核酸的膠上樣量
      由于DIG 系統的高靈敏度的特點，靶核酸的膠上樣量要小于其他的系統（Table 2）。同時DIG 系統匹配的
陽離子的尼龍膜也為DIG 標記的雜交檢測實驗提供了zui強的信號和zui低的背景影響。
檢測方法
       對于探針和靶序列間形成的雜交子的檢測通常使用堿性磷酸酶耦聯的抗體，采用顯色或化學發光法檢測（ta
ble 3）。在眾多的堿性磷酸酶的底物中，我們推薦使用CDP-Star 或CSPD 用于化學發光檢測，NBT/BCIP 用于
顯色反應。此外對于膜雜交中的化學發光信號的檢測，建議使用Lumi-Film 以獲得的信號。
探針的撥離和重探
      每一個探針的雜交信號都很強，基本上沒有什么背景信號。在探針的撥離過程中沒有明顯的靶RNA 的丟失。使
用探針撥離和重探技術，單一的一樣張膜上可進行多達14 次的檢測分析。

檢測底物
   即用型CDP-Star
      堿性磷酸酶作用于CDP-Star 底物，產生的光信號被X 膠片曝光或是圖像設備采集。與CSPD
相比較，CDP-Star 的主要特點在于由于光信號產生的速度更快（10 倍于CSPD）同時強度更強，可大量縮短曝
光時間。其信號的釋放可以持續大概兩天的時間，因此可以進行多次曝光。化學發光的底物僅僅適用于尼龍膜。
   即用型CSPD
      堿性磷酸酶作用于CSPD 底物，產生的光信號可被X 膠片（例如：Lumi-Film）或是圖像設備采集。由于其同樣
具有持續的發光過程，因此也可以進行多次曝光。在尼龍膜上使用CSPD 或CDP-Star 底物的雜交，還可進行探
針的撥離和重探。
  NBT/BCIP
      使用類似NBT/BCIP 顯色底物的好處就在于，檢測的過程中不在需要X 膠片，既可以使用尼龍膜也可以是使用
硝化纖維素膜。然而，如果想要獲得高靈敏度的檢測結果，可能就需要較長的時間了（幾個小時）。這種方法也
有其不足之處：首先通過這種方法只能一次性獲得信號，不能多次檢測；在探針撥離前，需要使用二甲基甲酰胺
先將膜上沉淀的顏色去除。
   其他的底物和抗體
      在整個DIG 系統中，還有其他的一些底物和多種熒光抗體，例如Fast Red Tablets, BM Purple, HNPP
Fluorescent Detection Set)和DAB POD Substrate；供不同研究的需要。